主要用途

冰冻切片神经组织金属锌改良蒂姆（Neo-TIMM）染色试剂是一种旨在使用新型蒂姆硫化法银染技术，分析存档中的冰冻组织切片里神经系统中含锌神经细胞结构分布的权威而经典的技术方法。该技术经过精心改良蒂姆（Timm）方法、成功实验证明的。主要适用于冰冻脑组织（海马齿状回门区hilus of dentate gyrus、安蒙氏角 cornu ammonis、大脑皮层、丘脑、杏仁核amygdala nuclei或外周神经组织切片，例如海马（hippocampus）中苔藓纤维区（mossy fiber region）和齿状分子层（dentate molecular layer）等含锌神经细胞体，例如锥体细胞（pyramidal cells）、齿状颗粒细胞（dentate granule cells）等检测。广泛用于脑神经病理生理，尤其是退行性神经病变包括癫痫、自闭症、精神分裂症、脑损伤、脑缺血等疾病的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景

蒂姆硫化法银染（Timm’s sulfide silver staining）是由蒂姆建立的用于观察脑组织和其它组织中（例如胰腺、小肠、睾丸、肾脏等）微量金属元素锌，以及其它重金属元素，例如铜、镍、钴和铁等的染色技术。主要用于观察中枢神经系统中含锌神经元，以及新轴突分枝（sprouted axon）和轴突终端（axon terminal）等结构，分析大脑灰质内部的海马中轴突终端（突触泡囊synaptic vesicle）、苔藓终端（齿状颗粒细胞dentate granule cells）中的反应性锌的分布，与突触活性和膜去极化的关系，研究神经退行性和癫痫病理性变化机制。其原理在于使用硫化物，与组织中的游离金属元素反应成为不溶性复合物沉积，进而在还原剂的作用下，金属硫化物催化还原离子银为可见金属银沉积，呈现棕黑色，此为金属自显影术（autometallography，AMG）。新型蒂姆硫化法银染技术（neo-TIMM）具有显示（visualization）改善的优点。

产品内容

硫化液（Reagent A）           毫升

固着液（Reagent B）            毫升

清理液（Reagent C）           毫升

染色液A1（Reagent D1）           毫升

染色液A2（Reagent D2）           瓶

染色液A3（Reagent D3）         毫升

染色液B（Reagent E）          微升

产品说明书              1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保证3月

用户自备

PBS缓冲液：用于灌注

无离子水：用于组织清洗

1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器

无菌镊子：用于转移动物脑组织

小型玻璃染色缸：用于组织或切片处理的容器

切片机：用于组织切片

明胶化载玻片和盖玻片：用于切片后铺片

中性树脂：用于切片封片

光学显微镜：用于切片染色后观察分析

实验步骤

一、 样本固着处理

1． 常规麻醉动物和手术（建议：使用用户自备的4℃预冷的PBS由心脏处灌注约5至10分钟，去除血液直至澄清，肝脏显示灰白）

2． 使用适量的（xx毫升）4℃预冷的硫化液（Reagent A）灌注处理（建议：至少10分钟，肝脏显示发黑）

3． 使用适量的（xx毫升）4℃预冷的固着液（Reagent B）灌注处理

4． 即刻小心取出脑组织（组织显示蓝灰色调）

5． 小心放进xx毫升固着液（Reagent B）里

6． 置于4℃冰箱里浸泡孵育60分钟

7． 转移到xx毫升硫化液（Reagent A）里

8． 置于4℃冰箱里浸泡孵育30分钟

9． 即刻用无菌镊子夹起组织块 

10． 放进用户自备的无离子水清洗2分钟

11． 用绵纸吸干组织快

12． 即刻进行常规4℃冰箱里30%蔗糖脱水过夜和OCT处理后包埋

13． 在－20℃条件下进行缓慢冰冻切片，为30微米厚，并铺片在明胶化载玻片上

14． 置于－20℃冰箱里保存

二、 样本染色处理

染色开始前，移取xx毫升染色液A3（Reagent D3）到1瓶染色液A2（Reagent D2），充分混匀后，再加入到1瓶染色液A1（Reagent D1）中，充分混匀；然后移取2毫升染色液A混匀液到2.2毫升离心管，加入xx微升染色液B（Reagent E），混匀后，标记为染色工作液（10张切片染色），置于暗室里备用。然后进行下列操作

1． 取出10片待测的30微米厚的冰冻组织切片

2． 小心加上xx微升清理液（Reagent C）铺满整个切片样品表面

3． 小心移去切片上的清理液（Reagent C）

4． 小心加上xx微升染色工作液，铺满整个切片样品表面

5． 26℃温度下孵育50分钟，避免光照

6． 小心移去切片上的染色工作液

7． 室温下，小心将切片置入xx毫升清理液（Reagent C）中孵育10分钟

8． 小心移去切片上的清理液（Reagent C）

9． （选择步骤）进行复染操作（建议使用甲苯酚紫（CRESYL VIOLET）复染试剂盒－GMS80052或中性红复染试剂盒—GMS80068）

10． 透明处理

11． 放上盖玻片或封片（中性树脂）

12． 即刻在一般光学显微镜下观察：含锌神经细胞体，例如锥体细胞、齿状颗粒细胞、突触泡囊等，呈现棕黑色（如果复染――细胞核呈现蓝色，胞浆尼氏（体）物质呈现粉红至紫色）

13． 齿状回内分子层苔藓纤维出芽（mossy fiber sprouting）评分

14． 其它结构区域染色评分

注意事项

1． 本产品为10次操作，其中20次染色操作

2． 操作时，须戴手套

3． 铺片须使用明胶化载玻片，否则染色会掉片：第一用毛笔涂刷；第二保持湿润3小时；第三用PARAFIN包裹后压片

4． 切片建议30至50微米，过厚和过薄不利于检测神经细胞

5． 注意操作安全，尤其使用固着液（Reagent B） 

6． 建议使用玻璃染色缸

7． 每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干

8． 试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面

9． 整个操作，在避光状态下进行

10． 染色完成后，即刻进行光学显微镜观察 

11． 样品染色后保存，避免光照

12． 锌分布参考图像如下：ao（olfactory bulb）：嗅球；cp（caudate putamen）：尾状壳核；am（amygdala）：杏仁体；h（hilus of dentate gyrus）：齿状回门区；s（subiculum of dentate gyrus in mossy fibers）：苔藓纤维齿状回门下脚；IV（IV layer of neocortex）：新皮质IV层 

13． 本公司提供系列神经系统成分染色试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定显色清晰

使用承诺

秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK，RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。