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glutathione peroxidase, GSH-Px

发布时间:2019-07-17

                              glutathione peroxidase, GSH-Px

分光光度法 50 /48 

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

GSH-Px 是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。GSH-Px

不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与 ROS 反应,生成氧化型谷胱甘肽 GSSG,从而保护

生物膜免受 ROS 的损害,维持细胞的正常功能;而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮

抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。

测定原理:

GSH-Px 催化 H2O2 氧化 GSH,产生 GSSG;谷胱甘肽还原酶(GR)催化 NADPH 还原 GSSG

再生 GSH,同时 NADPH 氧化生成 NADP+NADPH  340 nm 有特征吸收峰,而 NADP+

没有;通过测定 340 nm 光吸收减少速率来计算 GSH-Px 活性。

自备仪器和用品:

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配置:

试剂一:液体 100mL×1 瓶,室温保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,4保存。

试剂三:液体 20μL×1 支,-20保存。

混合试剂配制:临用前,在试剂二中加入试剂一 40 mL,充分震荡溶解后加入全部试剂三,

混匀。(注意:必须现配现用,当天使用完)

试剂四:液体 5.1mL×1 瓶,4保存。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL) 15~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,

加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g4离心 10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~10001 的比例(建

 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7

秒,总时间 3min);然后 8000g4,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

测定操作:

1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。

2. 混合试剂在 25或者 37(哺乳动物)水浴中预热 30min

3. 测定管:依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 试剂四、800μL 预热的混合试剂、100μL

上清液, 迅速混匀后于 340nm 处测定第 10 s 和第 190s 的吸光值,分别记为 A  1  A 

2A 测定管= A  1A  2

计算公式:

(1). 按蛋白浓度计算

GSH-Px 活力单位定义:一定温度中,每 mg 蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶

活单位。

GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[A 测定管÷ε÷d×V 反总×109Cpr×V 样)÷T

=536×A 测定管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

GSH-Px 活力单位定义:一定温度中,每 g 样本每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活

单位。

 GSH-Px (nmol/min/g)=[A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷(W×V ÷V 样总)÷T

=536×A 测定管÷W

3)按细胞数量计算

活性单位定义:一定温度中,每 104 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GSH-Px (nmol/min/104 cell)= [A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷(细胞数量×V ÷V 样总)÷T

=536×A 测定管÷细胞数量

4)按液体体积计算

活性单位定义:一定温度中,每毫升液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GSH-Px (nmol/min/mL)=[A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷V ÷T

=536×A 测定管

εNADPH 摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cmV 反总:反应体系总体积,1000μL=0.001 L

1061mol=1×106μmol Cpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);V 样:加入反应体系中上清液体

积,100μL =0.1 mLV 样总:加入提取液体积,1mLW,样本质量,gT:反应时间,3

min

注意事项:

1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力;

2)混合试剂和底物液须临用前配制,配完后置于冰上,当天使用完;

3)测定过程操作须迅速;

4)细胞中 GSH-Px 活性测定时,细胞数目须在 300 -500 万之间,细胞中 GSH-Px 的提

取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。