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中性转化酶试剂盒说明书

2016-09-07

 

中性转化酶(Neutral invertase, NI)试剂盒说明书

 

分光光度法 50 /24 

 

测定意义:

 

蔗糖转化酶(InvertaseIvr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH,将高等植物 Ivr 分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。

 

NI 主要存在于细胞质中,负责分解细胞质中蔗糖为果糖和葡萄糖。

 

测定原理:

 

NI 催化蔗糖分解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,在 510nm 有特征光吸收,在一定范围内 510nm 光吸收值与还原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算 NI 活性

自备用品:

 

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂组成和配制:

 

提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;试剂一:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 25mL 试剂一充分溶解备用;试剂三:液体 30mL×1 瓶,4℃保存;

粗酶液提取:

 

按照组织质量(g):提取液体积(mL) 15~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤和加样表:

 

试剂名称(μL

测定管

对照管

样本

200

200

试剂一

800

试剂二

800

 

混匀, 37℃准确水浴 30min 后,煮沸 10min 左右(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)

 

试剂三 500 500

 

混匀,煮沸 10min 左右(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀, 510nm 处蒸馏水调零,记录各管吸光值 A,如果吸光值大于 2,可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数),ΔA=A 测定-A 对照。

NI 活性计算:

 

标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0016x -0.001x 为标准品浓度(μg/mL),y 为吸光值。(1)按蛋白浓度计算:

单位的定义:37℃每 mg 蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。

 

NI 活性(U /mg prot)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

 

2)按鲜重计算:

 

单位的定义:37℃每 g 组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。

 

NI 活性(U /g 鲜重)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W V1:加入反应体系中样本体积,0.2mLV2:加入提取液体积,1mLT:反应时间,30minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本鲜重,g